FLAG란?
Sequence Alignment/Map (SAM) format에서 FLAG는 alignment section에서 2번째 column의 정보로, sequence가 alignment된 상태를 표현한다. FLAG는 총 12자리의 이진수를 십진수로 표현하며, 이진수의 각 자리가 0인지, 1인지에 따라 그 상태의 유무를 판단할 수 있다. 예를 들어, paired-end library로 시퀀싱된 read 두 쌍이 mapping되었으면 FLAG의 첫 번째 자리 수가 1이 된다. 만약 FLAG 첫 번째 자리수가 0이면 그 read는 쌍이 없다는 것이 된다.
FLAG는 bit로 표현된다
| Bit | 16진수 | Description |
|---|---|---|
| 1 | 0x1 | template having multiple segments in sequencing |
| 2 | 0x2 | each segment properly aligned according to the aligner |
| 4 | 0x4 | segment unmapped. mapping이 안 된 것을 의미한다. |
| 8 | 0x8 | next segment in the template unmapped |
| 16 | 0x10 | SEQ being reverse complemented |
| 32 | 0x20 | SEQ of the next segment in the template being reverse complemented |
| 64 | 0x40 | Paired reads를 mapping했을 때, 첫 번째 read를 의미한다. |
| 128 | 0x80 | Paired reads를 mapping했을 때, 두 번째 read를 의미한다. |
| 256 | 0x100 | Secondary alignment. Primary alignment가 아님을 의미한다. 하나의 read가 여러 군데 mapping되었을 경우, 첫 번째로 mapping된 경우가 아닌 것을 의미한다. |
| 512 | 0x200 | not passing filters, such as platform/vendor quality controls |
| 1024 | 0x400 | PCR or optical duplicate. |
| 2048 | 0x800 | supplementary alignment. Chimeric alignment. |
FLAG 예시
예를 들어, 아래 FLAG는 355 (256 + 64 + 32 + 2 + 1)이다. FLAG가 355인 alignment record는 쌍으로 매핑되고 (0x1), 두 read 모두 매핑되었고 (0x2), 첫 번째 read의 alignment (0x40)이며, 두 번째 alignment는 reverse complement (0x20)되었고, secondary alignment (0x100)인 것을 의미한다.
FLAG를 일일히 bit로 나누어 계산해보는 것은 복잡하다. Broad Institute에서 이를 쉽게 하도록 툴 (Decoding SAM Flags)을 개발해두었다.
특정 FLAG의 SAM record 추출
특정 FLAG의 alignment record를 추출하는 것은 samtools view를 이용하면 쉽게 할 수 있다. -f 옵션을 사용하면 포함하고 싶은 FLAG를, -F 옵션을 사용하면 제외하고 싶은 FLAG를 정할 수 있다. 만약 -f 3 옵션을 사용하면 0x1, 0x2를 포함한 모든 FLAG에 대한 alignment record를 출력한다.
예시
# Unmapped reads를 추출
samtools view -f 0x4 input.bam
# Paired reads만 추출 + Unmapped reads를 제외
samtools view -f 3 -F 0x4 input.bam